开展棉花体细胞胚胎发生的研究工作, 对于拓宽棉花种质资源和培育棉花品种具有重要意义。迄今关于棉花体细胞胚胎发生分子机制的研究仅见少量报道。近年来, 在拟南芥和其它植物组织的研究中已经证实了蛋白质组学是研究植物发育分子机制的有力工具, 目前已在棉花纤维发育、胚珠突变体等的研究中应用, 但在棉花体细胞胚胎发生上尚未见报道。蛋白质双向电泳是蛋白质组学研究中蛋白质分离的主要手段。然而, 双向电泳所涉及的环节较多, 尤其是棉花胚性培养物中含有大量的色素、多酚、醌、脂及其它多种次生代谢产物, 用常规方法不易去除干净, 对等电聚焦、SDS-PAGE 和凝胶染色的干扰较大, 影响了蛋白质的分离效果。基于此,本文以陆地棉Coker 201 胚性愈伤组织为材料,对蛋白质样品的制备方法进行了探讨, 初步建立了以棉花胚性培养物为研究对象的蛋白质双向电泳技术体系。
1 材料和方法
1. 1 供试材料及处理
陆地棉材料Co ker 201 的成熟种子经去壳消毒后, 种植在1/ 2MS 培养基上, 于( 28±1)℃下暗培养7 d 左右, 获无菌苗。取无菌苗下胚轴切成0. 5 cm 左右的小段, 平放于愈伤诱导培养基( MS无机盐, B5 有机物, 0. 45 Lmo l.L-1 2, 4-D, 0. 46Lmol. L-1 KT, 0. 1% (W/ V ) MgCl2. 6H2 O, 3%(W/ V) glucose) 上。诱导35 d 左右将愈伤组织转移到2, 4-D减半的愈伤诱导培养基上继代培养。以后每28 d 继代1次, 直至愈伤组织发生胚分化。把胚性愈伤组织转入分化培养基( MS 无机盐( 无NH4NO3 而KNO3 加倍) , B5 有机物,2. 46 Lmo l.L-1 IBA, 0. 70 Lmol.L-1 KT, 0. 1%(W/ V) Glu, 0. 1% ( W/ V) Asn, 3% ( W/ V ) glucose), 每28 d 继代1 次。愈伤的诱导和分化培养于28 ℃, 光照强度( 冷光源) 135 Lmol.m-2 .s-1 , 每天光照14h的条件下进行。所获得的胚性愈伤组织用于蛋白质的提取。
1. 2 化学试剂
尿素、硫脲、十二烷基磺酸钠( SDS) 均购自Sigma 公司, 二硫苏糖醇( DT T) 、3-[ ( 3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸( CHAPS)、I PG 缓冲液、标准蛋白质和线性IPG 胶条( pH 3~ 10, 长7 cm)均购自Bio-Rad 公司, 其余试剂为产分析纯产品。所有溶液均用超纯水配制。
1. 3 蛋白质的提取
比较了4 种蛋白质提取方法。各方法均称取0. 1 g 胚性愈伤组织, 加入0. 01 g PVPP, 用液氮研磨成粉, 并转入离心管中。
方法A: 参照Fer guson 和T urley的方法稍有改动。向胚性愈伤粉末中加入0. 5 mL 冷提取液( 500 mmol.L-1 T ris-HCl, pH 8. 65, 50mmo l.L-1 EDTA, 100 mmol.L-1 KCl, 2% ( V/V)B-巯基乙醇) 和0. 5 mL T ris-HCl 饱和酚( pH7. 9)中, 匀浆1 min, 然后于4℃ , 12000 @ g 离心10 min。收集界面和酚相, 加入0. 5 mL 冷提取液, 匀浆1 min, 4℃ , 12000 @ g 离心10 min, 重复3 次。收集后1 次萃取的界面和酚相, 加入5 倍以上体积的含0. 1 mo l.L-1 醋酸铵的冷甲醇, 混匀并于-20℃ 过夜。4℃ , 12000 @ g 离心10 min 后将沉淀用含0. 1 mo l. L-1醋酸铵的冷甲醇洗2 次, 80% 冷丙酮洗2 次。4℃真空干燥后,-80℃密封保存备用。
方法B: 先采用Yao 等的方法, 将胚性愈伤粉末完全悬浮于1 mL 冷丙酮中, 匀浆1 min 后于4℃, 12000 @ g 离心5 min。弃上清, 沉淀用1 mL 预冷丙酮再洗1 次。将得到的沉淀冻干30min, 然后采用方法A 所述的酚抽提法提取蛋白。方法C: 先按方法B, 将胚性愈伤粉末用1mL 冷丙酮洗2 次。再参照Wang 等的方法,将沉淀重悬浮于1 mL 含10% TCA 的预冷丙酮中, 彻底涡旋1 min 后, 于4℃, 12000 @ g 离心5min。弃上清, 将沉淀重悬浮于含0. 1 mol . L-1醋酸铵的80% 预冷甲醇中, 充分混匀后于4℃,12000 @ g 离心5 min。将得到的沉淀用80%预冷丙酮洗涤1 次后冻干30 min, 然后采用方法A所述的酚抽提法提取蛋白。
方法D: 先参照Wang 等的方法, 将胚性愈伤粉末用1 mL冷丙酮洗2 次后, 再用1 mL 含10% T CA 的预冷丙酮洗4次, 用1 mL 10%TCA 溶液洗2次, 用1 mL 80% 冷丙酮洗2次。将得到的沉淀冻干30 min, 然后采用方法A 所述的酚抽提法提取蛋白。
1. 4 蛋白质的溶解
利用提取方法C 所提取的蛋白质比较了3种有代表性的裂解液对样品的溶解效果。裂解液A 为8 mol. L-1 尿素, 2% (W/ V ) CHAPS, 0. 3%(W/ V) DTT , 0. 5% ( W/ V ) IPG buf fer( pH 3~10) ; 裂解液B 为9. 5 mol.L-1 尿素, 2% (W/V) CHAPS, 1% ( W/ V) DTT , 0. 8%( W/ V) IPGbuffer( pH 3~ 10); 裂解液C 为7 mo l. L-1尿素, 2 mol. L-1 硫脲, 4% ( W/ V ) CHAPS, 1%(W/ V) DT T, 0. 2% ( W/ V ) IPG buf fer ( pH 3~10)。不同提取方法的SDS-PAGE 和2-DE比较采用裂解液C 溶解蛋白质。各蛋白质样品用130 LL 裂解液溶解, 室温下, 反复涡旋和浸泡1 h, 使蛋白充分溶解。然后室温20000 @ g, 离心20 min。收集上清, 17℃ , 14000 @ g 再次离心20 min。上清液即为蛋白质溶液, 用于2-DE分析或SDS-PAGE 分析。用改良的Bradford法分析蛋白浓度, 以牛血清蛋白( BSA) 绘制标准曲线定量蛋白。
1. 5 SDS-聚丙烯酰胺电泳( SDS-PAGE)
采用Laemmli 的方法在垂直板电泳槽上进行电泳。浓缩胶浓度为4. 5%, 分离胶浓度为12% , 凝胶板厚为1mm。上样前, 将蛋白质样品溶液按1 B1 ( V/ V )的比例加入2 @ 上样缓冲液( 125 mmol.L-1 T ris-HCl, pH 6. 8, 4% SDS, 20%甘油, 100 mmol.L-1DT T, 0. 1% 溴酚蓝) , 37℃ 保温6 h。每泳道上样体积15LL。室温下, 先恒压50 V 电泳1 h, 然后恒压150 V 电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部边缘。各样品制备和SDS- PAGE 重复3 次。
1. 6 双向电泳
选用7 cm IPG 胶条( pH 3~ 10, NL) , 各样品补加溴酚蓝( 终浓度0. 001%) 后, 取125 LL 上样。20 e 下, 将胶条水化12 h, 接着在水平电泳仪( 北京六仪器厂) 中等电聚焦, 程序如下: 250 V, 30 min; 500 V, 30 min; 4000 V, 3 h; 后稳定在4000 V 下进行直至达到20 kV h。每根胶条限流50 LA。聚焦完成后, 将聚焦好的胶条依次在含有2% ( W/ V ) DTT 和2. 5% ( W/ V) 碘乙酰胺的平衡液( 6 mmol. L-1 尿素, 2% SDS,375 mmol.L-1 T ris-H Cl pH 8. 8, 20% 甘油) 中各平衡15 min。然后将胶条放置于垂直的12%的自制凝胶的端, 加入分子质量标准蛋白, 用封胶琼脂糖封固胶条后进行SDS- PAGE 电泳。各样品制备和2-DE 重复3 次。
1. 7 染色和图像扫描
电泳结束后采用Blue silver 法染色。用UMAX Aust ra 5400 扫描凝胶。
